A produção de bioetanol a partir de açúcares extraídos de cana-de-açúcar ou de milho contribui tanto para o desenvolvimento econômico do país, como para o meio ambiente, por se tratar de um recurso renovável, com produção líquida de carbono neutra. Entretanto, para melhorar o aproveitamento dos cultivares já plantados no país, a utilização da biomassa lignocelulósica é uma excelente alternativa como fonte de carbono para a produção de etanol de segunda geração. Contudo, o uso de enzimas para a sacarificação enzimática da lignocelulose presente nessa biomassa representa um dos maiores custos no modelo de negócios de uma planta industrial, chegando a 45% do valor de produção do etanol. Ainda, o fornecimento de enzimas em escala industrial para sacarificação de biomassa lignocelulósica é feito por apenas uma empresa no mundo, situada fora do Brasil. Dessa forma, são necessários estudos de produção de coquetéis enzimáticos eficientes, de tecnologia nacional, com bom rendimento de açúcares fermentescíveis (C5 e C6), além do baixo custo de produção. O presente projeto propõe o screening de fungos filamentos para a produção de um coquetel de holocelulases. Estes micro-organismos serão avaliados quanto a possibilidade de crescerem em sistema de co-cultivo, em biorreator de batelada, utilizando resíduos industriais como fonte de carbono. Uma vez produzido o extrato enzimático, esse será caracterizado e utilizado para a hidrólise da palha de cana. Para aumentar o rendimento do bioprocesso, serão expressas heterologamente enzimas chaves para o processo de conversão da biomassa lignocelulósica, que se juntarão ao coquetel gerado por co-cultivo. Para isso, serão utilizados dois sistemas modelos, a expressão heteróloga na levedura Picchia pastoris, além da expressão no fungo filamentoso Aspergillus nidulans. Nesse projeto almeja-se desenvolver um processo de produção de um coquetel enzimático em sistema on site manufacture (OSM), o qual deverá ser implantado na planta de produção de etanol de segunda geração da GranBio SA, localizada em Alagoas, Brasil. (AU)

O antimicrobiano gerador de radicais livres (formulação denominada Oniorgan) é uma formulação em forma sólida resultante da mistura de quatro princípios ativos que em solução aquosa produzem os princípios ativos (peróxido de hidrogênio, ácido peracético e oxigênio), sanitizantes de alta eficiência encontrados atualmente na forma líquida, portanto requerem cuidados especiais no manuseio, transporte e armazenagem por serem tóxicas e explosivas. O Oniorgan será oferecido de forma sólida (não requerendo cuidados adicionais por não serem tóxicos em seu manuseio) e será ativado através de diluições com liberação dos geradores de radicais livres como alternativa de descontaminação inédita do processo de produção de bioetanol. O objetivo do presente projeto é dar continuidade no desenvolvimento da formulação do Oniorgan em escala de laboratório, que nos permitirão avaliar a dosagem mínima e forma de aplicação em processo de produção de bioetanol, para atingir a máxima excelência do produto evitando dosagens excessivas. Resultados preliminares obtidos em processos fermentativos, em escala de laboratório e industrial, indicam que o Oniorgan (utilizado em concentração de 200 ppm) é eficiente na descontaminação bacteriana. Os dados apresentaram aumento médio de produção de bioetanol da ordem de até 3%. O Oniorgan será produzido em parceria com a empresa Onibras e será dissolvido e analisado em resposta aos teores de princípios ativos para dosagem e controle de qualidade do produto. A levedura Saccharomyces cerevisiae livre de antimicrobianos e antibióticos e o mosto de caldo de cana-de-açúcar serão obtidos do processo industrial de produção de bioetanol do Grupo São Martinho-Santa Cruz. Os ensaios de fermentabilidade serão realizados em parceria com a Universidade Estadual Paulista (UNESP), Faculdade de Ciências Farmacêuticas (FCF), Departamento de Engenharia de Bioprocessos e Biotecnologia. O mosto de caldo de cana-de-açúcar será inoculado com creme de Saccharomyces cerevisiae. As fermentações serão conduzidas por 8h e monitorada as seguintes variáveis: pH, açúcares, etanol, ácidos orgânicos, viabilidade e vitalidade do levedo, além do nível de contaminação bacteriana. O vinho e o levedo serão ambos recuperados por centrifugação. Nesta etapa o levedo será tratado com diferentes cargas de Oniorgan em meio ácido ou próximo do neutro a fim de se determinar a concentração ideal do produto inovador. Os ensaios de fermentabilidade previamente selecionados na etapa anterior serão avaliados em comparação ao uso de monensina e óxido de cloro, sendo o levedo previamente recuperado ao final e avaliado quanto aos teores de organoclorados e monensina. Em relação ao potencial comercial do Oniorgan, há um amplo mercado, em especial no setor sucroenergético, que faz uso contínuo dos princípios ativos monensina (antibiótico) e óxido de cloro, os principais antimicrobianos usados para controle de contaminação bacteriana em processos fermentativos de produção de bioetanol. (AU)

As xilanases são hemicelulases que quebram o xilano em pentoses solúveis. Eles são usados para fins industriais, como branqueamento de papel, clarificação de bebidas e produção de biocombustíveis. A produção de bioetanol de segunda geração é dificultada pela etapa de hidrólise enzimática da biomassa lignocelulósica, devido ao complexo arranjo estabelecido entre seus constituintes. As xilanases podem potencialmente aumentar o rendimento da produção, melhorando a ação do complexo enzimático celulolítico. Nós prospectamos endo-²-1,4-xilanases de metatranscriptomas do cupim Heterotermes tenuis. A caracterização estrutural in silico e a análise funcional de uma en-do-²-1,4-xilanase de um protista simbiótico de H. tenuis indicam dois sítios ativos e um sulco de ligação ao substrato necessários para a atividade catalítica. Não foram encontrados sítios de N-glicosilação. Esta endo-²-1,4-xilanase foi expressa recombinantemente em células de Pichia pastoris e Escherichia coli, apresentando massa molecular de aproximadamente 20 kDa. O ensaio de atividade enzimática usando endo-²-1,4-xilanase recombinante também foi realizado em ágar xilano a 1% corado com vermelho do Congo a 30°C e 40°C. A enzima expressa em ambos os sistemas foi capaz de hidrolisar o substrato xilano, tornando-se um candidato promissor para futuras análises visando determinar seu potencial de aplicação em processos industriais de degradação de xilano. (AU)

A produção de combustíveis de fontes renováveis está entre os tópicos de pesquisa mais importantes da atualidade. No Brasil, o desenvolvimento de processo de produção de etanol a partir de bagaço de cana-de-açúcar tem especial relevância, considerando-se a elevada disponibilidade desta matéria prima. A viabilidade econômica da produção de etanol 2G, no entanto, requer o aproveitamento integral da matéria prima em um contexto de biorrefinaria, sendo que as pesquisas atuais têm sido direcionadas à produção deste álcool a partir da glicose presente em hidrolisados celulósicos obtidos por via enzimática. A fração hemicelulósica, que pode representar até um terço da massa do bagaço, pode ser hidrolisada a pentoses, as quais podem ser convertidas a etanol ou outros produtos de maior valor agregado. Entre os produtos que podem ser obtidos de hexoses e pentoses, a pululana corresponde a um biopolímero com aplicações de interesse das indústrias alimentícia e farmacêutica. O aproveitamento dos carboidratos presentes na biomassa em bioprocessos tem sido feito empregando-se uma etapa inicial de pré-tratamento, a qual resulta em maior digestibilidade enzimática da celulose presente no material em etapa de hidrólise subsequente. Diversas alternativas têm sido estudadas e, recentemente, métodos de pré-tratamento inovadores assistidos por sistemas de cavitação hidrodinâmica foram avaliados e apresentaram resultados promissores. Experimentos iniciais realizados no Laboratório de Biopolímeros, Biorreatores e Simulação de Processos da Escola de Engenharia de Lorena/Universidade de São Paulo indicaram também que a hidrólise enzimática do material pré-tratado pode ser beneficiada se assistida por cavitação hidrodinâmica. Além disso, as etapas de hidrólise e fermentação podem ser realizadas em separado ou de forma simultânea, sendo fundamental desenvolver estudos em biorreatores susceptíveis de ampliação de escala. Recentemente, foi proposto um sistema de reatores de coluna interligados e células imobilizadas que possibilita o desenvolvimento das etapas biológicas em simultâneo, porém empregando reatores separados, o que permite o uso de condições otimizadas para cada bioprocesso. Neste contexto, propõe-se o presente projeto visando-se ao desenvolvimento de tecnologias inovadoras empregando reatores de cavitação hidrodinâmica e sistemas de colunas interligadas para obtenção de produtos de interesse em biorrefinarias de bagaço de cana-de-açúcar. Inicialmente, o bagaço de cana-de-açúcar será pré-tratado por processos oxidativos assistidos por cavitação hidrodinâmica, sendo avaliada a influência de variáveis importantes como concentração de oxidante, óxido de ferro III, pH e temperatura. O material sólido obtido no pré-tratamento será empregado como matéria-prima em processo de hidrólise enzimática catalisada por preparação comercial de celulases em reator de cavitação, sendo também neste caso avaliada a influência de variáveis como carga enzimática, razão sólido:líquido inicial e temperatura de processo. Os hidrolisados obtidos serão usados para produção de etanol e pululana em biorreatores de coluna de bolhas, empregando, respectivamente, células de Scheffersomyces shehatae e Aureobasidium pullulans. O material pré-tratado em processo assistido por cavitação hidrodinâmica será utilizado também em sistemas de hidrólise e cofermentação simultâneas, nos quais serão empregados biorreatores de coluna interligados. Destes, um biorreator será empregado para a hidrólise enzimática das frações carboidrato do material, enquanto o outro biorreator de coluna irá conter células imobilizadas de S. shehatae para produção de etanol. Alternativamente, células de A. pullulans serão empregadas neste sistema para produção de pululana. Assim, o projeto contribui com abordagens inovadoras para a viabilização de bioprocessos de interesse para aproveitamento de matérias primas lignocelulósicas, resultando na geração de tecnologia nacional relevante e sustentável. (AU)

Os ambientes gastrointestinais de mamíferos herbívoros constituem complexos ecossistemas que possuem uma microbiota fermentadora composta, dentre outros microrganismos, por protistas ciliados. Esses protistas secretam enzimas fibrolíticas que atuam na digestão das fibras vegetais. Grande parcela desses ciliados pertence à subclasse Trichostomatia, que apresenta diversos problemas e inconsistências sistemáticas. Este projeto objetiva estudar a família Ophryoscolecidae (Ciliophora, Trichostomatia) por meio de reconstruções filogenômicas e desenvolver estudo genômico comparativo com foco em enzimas ativas para carboidratos ("CAZymes") detectadas nos genomas sequenciados. Abordagens filogenômicas serão usadas pela primeira vez em tricostomatídeos e deverão contribuir para entender a evolução da família Ophryoscolecidae, elucidando problemas sistemáticos e questões taxonômicas relevantes. Além disso, os estudos desses genomas podem abrir o campo para estudos aplicados relacionados à prospecção de enzimas com atividade fibrolítica para a produção de bioetanol. (AU)

A celulose é o polissacarídeo mais abundante na biomassa lignocelulósica, e está interligada com a lignina e a hemicelulose. O bioetanol pode ser produzido a partir da biomassa. Devido à dificuldade de quebra dessa biomassa, as enzimas ativas da celulose secretadas por fungos filamentosos desempenham um papel importante na degradação da biomassa lignocelulósica recalcitrante. Dessa forma, caracterizamos uma celobiohidrolase (AfCel6A) e uma monooxigenase lítica de polissacarídeo LPMO (AfAA9_B) de Aspergillus fumigatus após serem expressas em Pichia pastoris e purificadas. Os parâmetros bioquímicos sugeriram que as enzimas eram estáveis; a temperatura ideal era de ~ 60 ° C. A caracterização posterior revelou altos números de rotatividade (kcat de 147,9 s 1 e 0,64 s 1, respectivamente). Surpreendentemente, quando combinados, AfCel6A e AfAA9_B não agiram sinergicamente. A associação AfCel6A e AfAA9_B inibiu a atividade de AfCel6A, um resultado que precisa ser mais investigado. No entanto, a adição de AfCel6A ou AfAA9_B aumentou a atividade de sacarificação enzimática de um coquetel de celulase e a atividade da celulase Af-EGL7. A suplementação do coquetel enzimático com AfCel6A ou AfAA9_B aumentou o rendimento de açúcares fermentáveis de substratos complexos, especialmente bagaço de cana-de-açúcar explodido, em até 95%. O sinergismo entre o coquetel de celulase e AfAA9_B foi específico para enzimas e substratos, o que sugere um coquetel enzimático específico para cada biomassa em até 95%. O sinergismo entre o coquetel de celulase e AfAA9_B foi específico para enzimas e substratos, o que sugere um coquetel enzimático específico para cada biomassa (AU)

Em 2017 o governo federal criou a Política Nacional de Biocombustíveis (LEI Nº 13.576), denominada RenovaBio. Para a sua implementação e monitoramento o RenovaBio precisará estabelecer (e atualizar periodicamente) metas compulsórias anuais de redução de emissões de GEE para a comercialização de combustíveis e os requisitos para regulação técnica e econômica do Crédito de Descarbonização. Neste contexto, a presente proposta tem como objetivo derivar fatores de emissão dos gases do efeito estufa para as principais fontes de emissão das atividades agrícolas relacionadas a produção de etanol de cana-de-açúcar nos estados de Alagoas (maior produtor no Norte/Nordeste) e São Paulo (maior produtor na região Centro-Sul), como forma de contribuir com a Política Nacional de Biocombustíveis - RenovaBio. Para atingir o objetivo proposto, este projeto será composto por três etapas, são elas: i) derivação dos fatores de emissão de N2O proveniente da aplicação de vinhaça e fatores para mudanças nos estoques de C do solo nos diferentes sistemas de colheita de cana-de-açúcar em Alagoas e São Paulo; ii) Geração e síntese de dados e atualização dos fatores de emissão (setor agrícola) de diferentes práticas de manejo adotadas na região Centro-Sul do país; iii) Análise de sensibilidade, incluindo a avaliação dos efeitos dos fatores de emissão específicos nas estimativas de emissão de GEE pelo RenovaBio. Os principais resultados esperados, do ponto de vista técnico-científico, são: i) Derivar fatores de emissão de N2O devido a aplicação de vinhaça para os estados de Alagoas e de São Paulo; ii) Derivar fatores de mudança de C do solo para o cultivo de cana-de-açúcar (nos diferentes sistemas de colheita) para Alagoas; iii) Atualizar os fatores de mudança de C do solo para o cultivo de cana-de-açúcar (nos diferentes sistemas de colheita) para a região Centro-Sul; iv) Derivar fatores de emissão de N2O e CO2 para as principais fontes de emissão de solos manejados para a região Centro-Sul; v) Avaliar o impacto dos fatores de emissão desenvolvidos nas estimativas de GEE pela RenovaCalc; vi) Capacitação da equipe do IFAL para realizar amostragem de fluxos de GEE em sistemas agropecuários, e para operar o GCMS; vii) Formação de recursos humanos, visto que alunos de iniciação científica e pós-graduação atuarão no projeto em Alagoas e São Paulo. No que se refere aos impactos na sociedade, a presente proposta entende que contribuirá com a melhoria da Política Nacional de Biocombustíveis, por meio da geração de informações que irão permitir o estabelecimento das metas de redução de emissão, e o monitoramento das emissões / concessão de créditos de descarbonização, de forma mais consistente e representativas das condições de clima, solo e manejo do Brasil. Isto deve conferir ao RenovaBio maior credibilidade, e ainda, contribuir com o incentivo ao uso do etanol em substituição aos combustíveis fosseis, fortalecendo a cadeia produtiva dos biocombustíveis, o que deve se traduzir no aumento de emprego e renda no setor, e obviamente, ajudar na mitigação do aquecimento global e mudanças climáticas. (AU)

O estabelecimento bem-sucedido de uma indústria de etanol de segunda geração (2G) exige inovações tecnológicas importantes que ainda estão à espera de implementação efetiva. Um deles é o desenvolvimento de linhagens de levedura capazes de suportar compostos tóxicos (isto é, inibidores) durante a fermentação de hidrolisados lignocelulósicos (LCHs) derivados da biomassa da cana-de-açúcar. Este projeto coloca a questão de como a tolerância aos inibidores de LCH pode ser melhorada na levedura Saccharomyces cerevisiae pelo uso de ferramentas modernas de genética molecular e biologia sintética. Para abordar esta importante questão, estabelecemos um eixo colaborativo entre os grupos pertencentes ao Instituto de Pesquisas em Bioenergia (IPBEN, UNESP), o Laboratório Brasileiro de Ciência e Tecnologia (CTBE), e os principais parceiros da Universidade de São Paulo (IPBEN, UNESP) USP) e a Universidade de Queensland, Austrália. A rede colaborativa aproveitará abordagens experimentais inovadoras, tais como protocolos alternativos de evolução de laboratório adaptativo, mapeamento de loci de "quantitative traists", sequenciamento de próxima geração, competição assistida por citometria de fluxo e testes de fenotipagem, para descobrir a base genética da tolerância da levedura a hidrolisado rico em inibidores (LCH) do bagaço de cana-de-açúcar. O conhecimento produzido será fundamental para a concepção racional de uma linhagem de levedura hiper tolerante a LCHs, a qual será construída aplicando ferramentas modernas de genética molecular e a tecnologia de edição do genoma CRISPR / Cas9. A levedura sintética resultante é proposta para servir como um "chassi" robusto sobre o qual outras modificações genéticas (como o metabolismo das pentoses) podem ser adicionadas para produzir uma cepa de referência adequada para a produção de etanol celulósico. (AU)

As indústrias de produtos fermentados vêm demandando incessantemente alternativas para o aumento de rendimentos produtivos e redução dos custos de fermentação. Na indústria de bioetanol, o controle da temperatura do processo deve ser mantido próximo à 30°C por trocadores de calor ligados constantemente gerando custos e consumo de água substanciais. Nesse sentido, para que as leveduras consigam fermentar adequadamente em temperaturas elevadas, elas devem ser termotolerantes e resistentes às condições de estreses impostas durante o processo produtivo. Já na indústria da cerveja, anseia-se por linhagens que produzam um produto de alta qualidade e com um aumento na eficiência do consumo de açúcares tais como maltose e maltotriose. Neste contexto, diversas aplicações tecnológicas utilizando a engenharia genética e metabólica vem sendo empregadas. No entanto, estas modificações geram Organismos Geneticamente Modificados (OGMs) que possuem regulamentações restritivas para seu uso, principalmente em produtos alimentícios. Nesse sentido, a técnica conhecida como evolução adaptativa se torna uma excelente ferramenta para expressar e modificar diferentes fenótipos de leveduras. Nosso grupo de pesquisa vem desenvolvendo desde 2010 um projeto baseado no isolamento de leveduras obtidas nos processos das industrias brasileiras de bioetanol, obtendo um banco de linhagens contendo 289 isolados. O desafio deste trabalho está focado na utilização deste banco para a identificação de cepas com características de interesse visando atender as demandas das indústrias para melhorar o processo fermentativo. Nossos resultados iniciais visaram a identificação de leveduras presentes neste banco pertencente a espécie Saccharomyces cerevisiae. Para isso selecionamos as linhagens mediante a sua auxotrofia à lisina em placas com meio sólido utilizando este aminoácido como única fonte de Carbono. Dos 289 isolados, até o momento identificamos 124 linhagens pertencentes a espécie S. cerevisiae. Entre elas estão duas linhagens termotolerantes anteriormente identificadas, mas que necessitam de melhor adaptação para a resistência aos outros estresses encontrados no processo fermentativo de produção de etanol. Ressultados preliminares mostraram que estas duas linhagens apresentaram melhora na performance fermentativa e na capacidade de produção de massa celular quando induzidas em diversos ciclos usando temperaturas elevadas de XÚC. Com relação à produção de cerveja, conseguimos identificar até o momento 60 leveduras com a capacidade de crescimento em maltose, indicando um resultado promissor para a evolução destas linhagens para aplicação na produção industrial de cervejas. O desenvolvimento dessas linhagens poderá ter uma aplicação direta em processos fermentativos visando uma melhor qualidade do produto, aumentando sua capacidade fermentativa e reduzindo custos e tempo de produção. Esperamos portanto que nossos resultados contribuam de maneira significativa no aumento de potencial produtivo das indústias ligadas a este ramo de produção e também que possam melhorar o entendimento das vias metabólicas ativadas e represas nestas linhagens, contribuindo com dados importante para a comunidade científica. (AU)

O etanol é um combustível derivado de fontes renováveis de energia, entretanto, os principais processos de produção utilizam biomassas que também são utilizadas como alimento. Por esse motivo, é necessário novas tecnologias que usem fontes alternativas como matéria-prima, como a produção de etanol de segunda geração que utiliza biomassa lignocelulósica em seu processo. Essa biomassa pode ser em forma de bagaço, palha, ponteira de plantas, cascas, ou seja, produtos que são resíduos de uma produção agrícola ou plantas que de alguma forma causam problemas para a produção, como o aguapé que em pouco tempo pode cobrir o leito de um rio, causando eutrofização do mesmo. Um exemplo de resíduos agrícolas é a planta que sobra depois da colheita do abacaxi, o abacaxizeiro. Como é uma biomassa vegetal contém em sua estrutura celulose que pode ser degradada em glicose e essa utilizada como substrato para a produção de etanol. Entretanto, durante a hidrólise enzimática da celulose, a glicose se torna um fator limitante, pois o seu acúmulo no biorreator causa inibição na enzima celulase, e isso implica em uma menor produção dessa hexose, resultando em um menor rendimento na produção de etanol. Por isso, propõe-se o desenvolvimento de sensores aliados à grande potencialidade eletroquímica do grafeno e à especificidade da enzima de glicose para o monitoramento e quantificação de açúcar no processo de produção de etanol 2G. (AU)